Rosuvastatina 136

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Rosuvastatina riduce la formazione di neointima in un modello murino di balloon injury astratti processi in background di restenosi, a seguito di lesione arteriosa, sono complessi che coinvolgono diversi tipi di cellule che producono varie citochine ed enzimi. Tra questi enzimi, lisce metalloproteinasi di matrice derivati ​​dalle cellule muscolari (MMP) sono pensati per prendere parte nella migrazione cellulare, degradante della matrice extracellulare, e la formazione di neointima. MMP-9, nota anche come gelatinasi B, viene espresso immediatamente dopo danno vascolare e la sua espressione e l'attività può essere inibita da statine. Utilizzando un modello istituito nel vivo di danno vascolare, abbiamo studiato l'effetto della HMG-CoA reduttasi rosuvastatina su MMP-9 espressione e la formazione di neointima. Materiali e metodi 14 settimane di età di sesso maschile ratti Sprague Dawley sono stati sottoposti a lesioni palloncino della carotide comune. La metà degli animali ha ricevuto rosuvastatina (20 mg / kg di peso corporeo / giorno) tramite sonda gastrica, iniziando 3 giorni prima di un infortunio. attività gelatinasi e formazione della neointima sono stati analizzati 3 giorni e 14 giorni dopo la lesione palloncino, rispettivamente. 14 giorni dopo la lesione vascolare, attività proliferativa è stata valutata mediante colorazione per Ki67. Risultati Dopo 14 giorni, gli animali del gruppo rosuvastatina hanno mostrato una diminuzione nella formazione di neointima totale (0.194 0,01 millimetri 2 contro 0.124 0,02 millimetri 2. p 0,05). balloon injury ha provocato un aumento dell'attività di MMP-9 3 giorni dopo l'intervento per entrambi i rosuvastatina animali trattati e controlli con nessuna differenza significativa osservata tra i gruppi. C'è stata una tendenza alla riduzione del numero di cellule positive Ki67-14 giorni dopo la lesione. Conclusioni Rosuvastatina attenua la formazione di neointima senza influire precoce attività di MMP-9 in un modello murino di danno vascolare. Introduzione arteriosa restenosi dopo angioplastica con palloncino rimane una limitazione clinica comune anche dopo l'impianto dello stent 1. Questo effetto è causato principalmente dalla formazione della neointima accelerato a causa della migrazione delle cellule muscolari lisce e la proliferazione dopo un danno endoteliale 2. Diversi meccanismi fisiopatologici sono stati discussi. Alcuni studi suggeriscono profusa guarigione della ferita vascolare a causa di cellule endoteliali adiacenti e progenitori endoteliali 3. 4. Altri hanno dimostrato una TGF - meccanismo dipendente del rimodellamento arteriosa costrittiva e formazione di ispessimento intimale composto di cellule muscolari lisce 5. In parte, rimodellamento vascolare è anche indotta dal rilascio di enzimi di degradazione della matrice SMC, come metalloproteinasi della matrice e gli inibitori tissutali delle metalloproteinasi della matrice (TIMP) 6. 7. In particolare, MMP9 è upregulated dopo un trauma nave 8. L'inibizione di MMP ha provocato una diminuzione della proliferazione di SMC e l'inibizione della neointimale 9. 10. Poiché è noto che idrossimetilglutaril coenzima A (HMG-CoA) reduttasi sono utili nella prevenzione primaria e secondaria delle malattie cardiovascolari, e che i loro effetti pleiotropici sono indipendenti del loro potenziale di riduzione dei lipidi, alcuni studi si sono concentrati sugli effetti della terapia con statine sulla prevenzione della restenosi 11 17. Diversi in vitro e in vivo hanno dimostrato la riduzione di MMP-9 espressione in seguito al trattamento con statine 19. 20. Recentemente, è stato dimostrato che la potente HMG-CoA reduttasi rosuvastatina riduce la formazione di neointima in un modello di ratto iperteso 16. Inoltre promuove rosuvastatina midollo osseo dipendente ri-endotelizzazione e riduce la formazione di neointima nei topi 21. Il nostro studio ha valutato l'effetto della Rosuvastatina sulla MMP-9 e la formazione di neointima in un modello murino di danno vascolare. Materiali e Metodi Animali e trattamento farmacologico Venti due Sprague Dawley maschi ratti (380-420 g Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germania) all'età di 14 settimane sono stati tenuti all'interno della struttura di cura degli animali dell'Università di Heidelberg. Gli animali hanno ricevuto acqua libera e il cibo (dieta chow standard) ad libitum in una stanza a temperatura controllata con un ciclo di 12 ore di luce / buio. Gli animali sono stati divisi casualmente in rosuvastatina gruppo trattato e di controllo. Partendo tre giorni prima del palloncino lesioni, metà dei ratti hanno ricevuto rosuvastatina (20 mg / kg di peso corporeo / giorno) con sonda gastrica. Un certo numero di ratti sono stati eutanasia 3 giorni dopo la lesione palloncino per immunoblot e test gelatinolitica. Per la valutazione della formazione della neointima, ratti supplementari sono stati sacrificati 14 giorni dopo l'infortunio. Corpo e la cura degli animali, e le procedure svolte in questo studio sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti composta dal Comitato Animal Care dell'Università di Heidelberg. I ratti sono stati anestetizzati balloon injury mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (15 mg / kg di peso corporeo). Dopo incisione mediana del collo, l'arteria carotide esterna sinistra è stata esposta e un catetere a palloncino 2F (Baxter Healthcare) è stato introdotto fino all'uscita aortica dell'arteria carotide comune. Il pallone è stato quindi gonfiato con soluzione salina fino ad una leggera resistenza è stato percepito. Durante la rotazione, il pallone è stato tirato indietro attraverso l'arteria carotide comune per spogliare l'endotelio. Questa procedura è stata ripetuta due volte. Successivamente, il catetere è stato rimosso, l'arteria carotide esterna ligato e la ferita è stata chiusa. arterie controlaterale destro serviti come controlli illeso. Tre e 14 giorni dopo i topi sono stati anestetizzati chirurgia come descritto in precedenza, il sangue è stato raccolto dalla vena cava inferiore, conservato per un ulteriore uso, e gli animali sono stati eutanasia per dissanguamento. I ratti sono stati perfusi con 20 ml di soluzione salina tamponata con fosfato a pressione fisiologica via ventricolo sinistro. A destra ea sinistra delle arterie carotidi comuni sono stati asportati, il tessuto connettivo aderente è stato rimosso e conservato a -80C. Determinazione dei livelli di lipidi plasmatici del colesterolo sierico totale, lipoproteine ​​ad alta densità (HDL) e colesterolo delle lipoproteine ​​a bassa densità (LDL) sono stati determinati per via enzimatica nel plasma eparinizzato. analisi morfometrica di neointima formazione / immunoistochimica arterie carotidi comuni erano in serie sezionato (5 m) e colorati con ematossilina-eosina (HE). Le sezioni sono state valutate cieco utilizzando il computer-assistita morfometria (Olympus Mikroskopie Amburgo, Germania e Image Pro, Media Cybernetics, Silver Spring, Stati Uniti d'America). La dimensione dello strato neo-intimale è stato determinato come l'area tra lamina elastica interna e la circonferenza luminale (dati espressi in mm 2). Inoltre, il numero totale di cellule è stata valutata contando nuclei. Inoltre, i rapporti neointima / media sono stati calcolati da un osservatore cieco. Per determinare la proliferazione e l'integrità endoteliale, sezioni seriali sono state colorate per Ki67 con un anticorpo policlonale di coniglio (Abcam, Cambridge, UK), un coniglio fattore di von Willebrand anticorpale (Dako, Carinteria, CA, USA) e una direttamente FITC coniugato actina del muscolo - liscia anticorpi (Sigma-Aldrich, San Luis MO, USA). indice di proliferazione è stato calcolato come numero di cellule Ki67-positive / quantità totale di cellule. estrazione di proteine ​​per western blot e saggio gelatinolitica Per dosaggio gelatinolitica, arterie congelati sono stati omogeneizzati con tampone di lisi (50 mmol / l Tris-HCL, pH 7,6 a 150 mmol / l NaCl 5 mmol / l CaCl 2 0,05 Brij-35 0 , 02 NaN3 1 Triton X-100). I lisati sono state tranciate dalla rottura ultrasuoni, e centrifugati a 14.000 r. p.m a 4 ° C per 10 minuti. Surnatanti sono stati utilizzati come lisati cellulari totali e la concentrazione di proteine ​​è stato determinato utilizzando il metodo di Bradford (Bio-Rad Protein Assay). saggio gelatinolitica Dieci g di proteine ​​sono stati usati per analizzare l'attività gelatinase tessuto vaso. attività gelatinase è stata rilevata in un gel 10 di gelatina (Invitrogen, Carlsbad, Stati Uniti d'America) utilizzando SDS tampone di corsa (tutte le sostanze chimiche Invitrogen, Carlsbad, Stati Uniti d'America). Dopo l'elettroforesi, gel sono stati incubati con tampone zimogramma rinaturazione per 30 minuti e sviluppati in zimogramma buffer di sviluppo per 12 ore. I gel sono stati colorati con Coomassie blue 0,125 R-250 per 30 minuti a 10 acido acetico e 50 metanolo. Infine, gel sono stati decolorato con una soluzione contenente 10 acido acetico e 10 metanolo fino chiare bande di gelatinolysis apparso su uno sfondo blu scuro. Il peso molecolare delle bande gelatinolitica stato stimato per confronto con marcatori di peso molecolare Prestained (Bio-Rad, Monaco, Germania). I gel sono stati asciugati e scansionati da densitometria. Western Blotting Dieci g di proteine ​​sono state separate da 10 SDS-PAGE gel (Invitrogen, Carlsbad, Stati Uniti d'America) e trasferiti su membrane di nitrocellulosa (Schleicher und Schuell, Germania). Dopo il blocco (5 nonfat latte in polvere sciolto in TBST) la membrana è stata incubata con l'anticorpo primario (policlonale di capra anti topo MMP-9, diluizione 1: 2000) per una notte a 4 ° C, lavate tre volte con TBST, seguita da incubazione con un anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio, le bande sono state visualizzate con ECL (Amersham Biosience, Stati Uniti d'America), registrato su Hyperfilm (Amersham) e quantificati dalla densitometria (Bio-Rad). Gli anticorpi, utilizzati in questo studio, sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Stati Uniti d'America. Analisi statistica I dati sono stati espressi come media ± SEM o come media SD, come indicato. Differenze significative tra i mezzi in profili lipidici plasmatici sono stati determinati con gli studenti spaiati a due code t - test, differenze di dimensioni neointima utilizzando il test U di Mann-Whitney. Un valore p 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. Risultati effetto sui livelli di lipidi plasmatici Al momento dell'eutanasia, gli animali non ha mostrato differenze significative in colesterolo, HDL e LDL colesterolo totale. Inoltre, non vi erano differenze di peso corporeo (Tabella 1). Il peso corporeo e il profilo lipidico Nessuna differenza significativa nei livelli di colesterolo totale, HDL e LDL, così come il peso corporeo potrebbe essere rilevato. analisi morfometrica Rispetto ai controlli, il trattamento con piombo rosuvastatina ad una diminuzione della superficie neointima (0,194 0,01 mm 2 contro 0,124 0,02 millimetri 2. p 0,01). formazione Neonintima dell'arteria carotide comune (ematossilina / eosina) 14 giorni dopo la lesione palloncino in un animale di controllo (A) e un animale trattato con rosuvastatina. (B) Il trattamento con rosuvastatina porta ad una riduzione delle dimensioni neointima, nonché una riduzione del rapporto neointima / media. (C, D). Proliferazione / integrità dello strato endoteliale Ki67 colorazione è stata utilizzata per determinare la proliferazione. C'è stata una tendenza alla riduzione del numero di cellule Ki67-positive negli animali trattati con Rosuvastatina (2.1 0.17 contro 1.6 0.13 p 0,058). Tuttavia, la differenza non ha raggiunto la significatività statistica (Figura 2AB). cellule Ki67-positive (frecce) all'interno della neointima a 14 giorni dopo la lesione di un animale controllo. trattamento (A) rosuvastatina tendeva a ridurre l'indice di proliferazione nella neointima (numero di cellule Ki67-positive / quantità totale di cellule). Tuttavia al giorno 14 nessuna differenza significativa è stato possibile rilevare (p 0,058). (B) colorazione con immunofluorescenza marcato contro il fattore di von Willebrand (anticorpo Alexa secondario 594 in rosso) e - liscia actina muscolare a FITC (verde) ha dimostrato che reendotheliazation non è stato completato 14 giorni dopo la lesione (punta di freccia) (-liscia actina muscolare in FITC, verde). Un'arteria avventiziale è mostrato come un controllo positivo (freccia). (C) Scala bar 100 m. Due settimane dopo la lesione, le arterie hanno mostrato ancora incompleta ri-endotelizzazione, come valutato dalla colorazione con immunofluorescenza-anticorpo contro il fattore di von Willebrand e - liscia actina del muscolo. Nessuna differenza significativa tra i gruppi di trattamento potrebbe essere rilevato (dati non mostrati, Figura 2C). Gelatinolitica lesioni attività Balloon delle arterie di ratto upregulated espressione di una banda di 92-kD nel zimografia di gelatina 3 giorni dopo l'infortunio. Nessun segnale è stato rilevato nei vasi controlaterale non denudated (destra CCA), il che suggerisce che queste proteine ​​92-KD sono indotti da lesioni. Questa banda corrisponde ad una forma di ratto 95-kD tipo IV collagenasi / gelatinasi (MMP-9) 21. Tuttavia nessuna differenza potrebbe essere rilevato tra ratti trattati rosuvastatina e controllo (3754 1074 vs 3488 1816 Figura 3A). saggio di attività gelatinolitica dimostrato un'induzione di 92-kD gelatinase B tre giorni dopo la lesione pallone nel ratto arteria carotide comune. Nessuna differenza tra rosuvastatina trattati ei controlli potrebbe essere rilevato (A). Western Blot ha confermato MMP-9 espressione nelle arterie carotidi di ratto comune tre giorni dopo la lesione palloncino. Nessuna espressione significativa potrebbe essere rilevato in arterie controlaterale non feriti, che servivano come controlli (B). blotting l'espressione della proteina occidentale MMP-9 in CCA è stata determinata mediante Western blot nei ratti e nei controlli rosuvastatina trattata. balloon injury ha comportato un induzione di MMP-9 espressione nelle arterie 3 giorni dopo il de-endotelializzazione. vasi controlaterale nelle stesse ratti non hanno mostrato alcuna induzione di MMP-9. Anche in questo caso, non vi era alcuna differenza significativa tra rosuvastatina trattati e di controllo degli animali (Figura 3B). Discussione percutanea interventi coronarici (PCI) sono ampiamente utilizzati per il trattamento della malattia coronarica. Tuttavia, beneficio a lungo termine è spesso limitata da restenosi, che si verificano in circa il 30 dei pazienti seguenti bare metal stent 23. L'introduzione di droga eluting stent è diminuita l'incidenza di restenosi in modo significativo, ma è associato a diversi problemi come la trombosi dello stent 24. Rimodellamento processi della matrice extracellulare di MMPs sono essenziali per la formazione della neointima in restenosi postangioplasty nonché in aortocoronarico innesto venoso vasculopatia 8. 25. inibitori della HMG-CoA sono noti per sopprimere MMP-espressione e sono pertanto un potenziale opzione di trattamento in materia di prevenzione della restenosi 19. 20. 26. Utilizzando un modello animale standard danno vascolare siamo stati in grado di dimostrare una significativa riduzione della formazione di neointima in ratti trattati con rosuvastatina. Questi dati sono in accordo con altri studi su ratti e topi, mentre Kappert et al. (2006) solo osservato un aumento della circonferenza del lume ma nessuna differenza nella dimensione totale neointima, né intima / rapporto supporti 16. 17. 26. Prevenzione della restenosi con inibitori della HMG-CoA reduttasi potrebbe essere dose-dipendente. Kappert et al. (2006) usarono rosuvastatina alla dose di solo 1 mg / kg / die mentre noi e van de Harst (2006) somministrata rosuvastatina alla dose di 20 mg / kg / die, una dose precedentemente dimostrato di inibire epatica riduttasi HMG-CoA by 90 nei ratti 16 18. È stato dimostrato che danno vascolare provoca upregulation precoce di metalloproteinasi della matrice-2 (MMP-2, gelatinasi A) e matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9, gelatinasi B) e quindi potrebbe svolgere un ruolo importante nella migrazione SMC 8. Utilizzando pallone deendothelialization, un metodo efficace per causare gravi danni vascolari, abbiamo dimostrato che l'attività gelatinasi B è upregulated 3 giorni dopo l'intervento. Tuttavia, il trattamento con rosuvastatina ha avuto alcun effetto sulla espressione o attività gelatinolitica di gelatinase B dopo l'infortunio palloncino. Pertanto, la prevenzione della restenosi con rosuvastatina deve agire attraverso un meccanismo di MMP-indipendente. In linea con altri studi, abbiamo trovato cellule Ki67-positivi all'interno della neointima di tutti gli animali di 14 giorni dopo l'infortunio. C'è stata una tendenza verso una ridotta espressione nel gruppo rosuvastatina-trattati, rispetto ai controlli. Proliferazione dopo la lesione arteriosa viene comunemente descritto come un evento precoce, che raggiunge un massimo all'interno dello strato intimale tra il giorno quattro e sette 27. È possibile che la tendenza osservata nel nostro studio avrebbe raggiunto significatività statistica a un punto temporale precedente, valutata nel presente studio. Altri studi hanno anche dimostrato una forte associazione tra gravi lesioni arteriose con interruzione della lamina interna elastica (IEL) e l'espressione di Ki67. Così, la variabilità nella gravità delle lesioni tra i diversi studi può anche contribuire a differenze di andamento temporale della proliferazione 28. In linea con altri studi, le cellule proliferanti sono quasi esclusivamente situati nella superficie luminale. i dati pubblicati recentemente dimostrato effetti antiproliferativi della Rosuvastatina in un modello ex-vivo di balloon injury via urokinase di tipo recettore attivatore del plasminogeno (uPAR) 29. Inoltre, i dati acquisiti dal nostro gruppo e altri hanno mostrato effetti inibitori delle statine sull'attività dei fattori di trascrizione Egr-1, NF-kB e AP-1 30. 31. Le celle adiacenti della parete vascolare intatto sono i principali responsabili per la riparazione delle ferite dopo l'infortunio 3. Dati recenti supportano la possibilità che le cellule del midollo osseo, che circolano nel sangue contribuiscono neoangiogenesi e accelerare ri-endotelizzazione portando ad una riduzione della formazione di neointima 32. 33. Werner et al. (2002) hanno dimostrato gli effetti benefici di cellule progenitrici endoteliali in un modello murino di lesione della carotide: il trattamento con rosuvastatina accelerato nuovamente endotelizzazione e ha ridotto significativamente la formazione neointimale 21. Tuttavia, non è chiaro se ciò sia dovuto ad un effetto diretto della terapia con statine oa causa di un aumento di statina-mediata del numero di circolazione, immature, cellule endoteliali 34. Abbiamo osservato una mancanza di ri-endotelizzazione a 14 giorni dopo la lesione che non è stata influenzata dal trattamento con statine. Le differenze nel recupero endoteliale tra studi possono essere spiegati con interasse variabile endotelio untraumatized e aree denudate, poiché la rigenerazione, almeno in parte, inizia dallo strato endoteliale non feriti adiacente 35. E 'stato riportato che anche il più tardi sei settimane dopo la lesione, alcune aree dell'arteria ancora rimaste senza endotelio 36. Nuovi dati, inoltre, hanno dimostrato una associazione tra il trattamento con statine e la riduzione del rischio di trombosi venosa che implica un effetto di inibizione dell'HMG-CoA reduttasi e del sistema di coagulazione 31. 32. Gli studi hanno dimostrato un'inibizione statina-indotta del fattore tissutale procoagulatory e addirittura proposto attività del fattore tissutale come predittore del rischio di restenosi dopo PCI e impianto di stent 37 40. Gli studi clinici hanno suggerito che ipolipemizzante con statine protegge da restenosi dopo stenting coronarico 41. 42. E 'stato dimostrato che la Rosuvastatina significativamente diminuito LDL, colesterolo e livelli glycer ide tri e che alte dosi di trattamento Rosuvastatina è risultata più efficace dosi simili di atorvastatina nel ridurre LDL colesterolo diretta 43. Al contrario, il nostro modello, al momento della necroscopia, non ha evidenziato differenze di colesterolo totale, LDL, HDL o tra i gruppi che conferma anche un effetto colesterolo indipendente sulla formazione della neointima nel nostro vivo-modello. La mancanza di un effetto ipocolesterolemizzante delle statine nei roditori è stata valutata in diversi studi e sembra essere molto comune, anche a dosi elevate 44. 45. I meccanismi come il trattamento con statine di apoE - / - mice provoca anche un aumento del colesterolo sierico, come osservato in alcuni studi, non è ancora chiaro 46. Una possibile spiegazione è che la somministrazione continua di statine tramite chow stimola anche espressione e / o l'attività di HMG-Co A reduttasi nel fegato di topi trattati. In conclusione, il nostro studio dimostra che rosuvastatina inibisce la formazione di neointima dopo balloon injury e supporta l'ipotesi che questo effetto è MMP9 indipendente. Note E Benedizione e R Kranzhfer contribuito in maniera uguale a questo lavoro. dichiarazioni